菌落總數(shù)檢測是指在被檢樣品的單位重量(g)、容積(mL)或表面積(clni)內(nèi)，、所含能于某種周體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的細菌集落的總數(shù)。
在對食品進行菌落總數(shù)檢測時，是將食品檢樣做成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從各個稀釋液中分別取出一定量在平皿內(nèi)與營養(yǎng)瓊脂相混合，經(jīng)培養(yǎng)后，按一定要求計算出皿內(nèi)瓊脂平板上所生成的細菌集落數(shù)，并再根據(jù)檢樣的稀釋倍數(shù)，計算出每g或mL樣品中所含細菌菌落的總數(shù)。
菌落總數(shù)檢測中的一些要求和規(guī)定：
為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗時必須遵循以下一些要求和規(guī)定：
(一)所用器皿及稀釋液：
1．檢驗中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是*滅菌的，并在滅菌前*洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
2．用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
3．檢樣的稀釋液雖可用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，但以用磷酸緩沖鹽水為合適，因為磷酸鹽緩沖液對細菌細胞有更好的保護作用，不會因為在稀釋過程中而使食品檢樣中原已受損傷的細菌細胞導(dǎo)致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如，醬品等)進行稀釋，則宜采用蒸餾水。
(二)檢樣稀釋：
1．檢樣稀釋時，應(yīng)以無菌操作稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225mL滅菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖作成l:10的稀釋液。如，系肉、魚等固體樣品，剪細于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯或拍擊式均質(zhì)袋中，使做成均勻的1:10稀釋液。
2．根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)吮疚廴厩闆r的估計，將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成l:100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1:1000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支lmL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準確。
3．從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時，不要將吸管碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因為這些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
4．在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液砸2.5cm；吸入液體時，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管離開液面，將貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時不會有多余的液體粘附于管外。
5．當用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
(三)平板接種與培養(yǎng)：
1.將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)吮疚廴厩闆r的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋)，后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應(yīng)作2個平皿。
2.用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂應(yīng)預(yù)先加熱使融化，并保溫于45±1℃恒溫水浴中待用。傾注平皿時，每皿內(nèi)傾入約15~20mL，后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
3.為了防止細菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂，并立即使其與瓊脂混和均勻。
4.檢樣與瓊脂混和時，可將皿底在平面上先向一個方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反的方向旋轉(zhuǎn)，以使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心，不要使混和物濺到皿邊的上方。為了保證混和均勻，而不濺及皿邊的上方，可使用自動平皿旋轉(zhuǎn)儀，直接將加有檢樣的平皿放在旋轉(zhuǎn)儀上(可同時放4只平皿)，加入瓊脂后，開動電鈕，在數(shù)十秒鐘內(nèi)即可自動左右旋轉(zhuǎn)而使皿內(nèi)的檢樣與瓊脂混合均勻。
5.皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長久放置，然后始翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，而應(yīng)于瓊脂凝固后，在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長。必要時，可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內(nèi)經(jīng)15~60分鐘使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運動性強的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴展生長。
6.為了控制污染，在取樣進行檢驗的同時，于工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露的時間，應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的長的時間相當，然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以了解檢樣在檢驗操作過程中有l(wèi)無受到來自空氣的污染。
7.培養(yǎng)溫度：
應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng)，水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為48±2小時。培養(yǎng)溫度和時間之所以有這種不同的區(qū)分，乃是因為在制定這些食品衛(wèi)生標準中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產(chǎn)品細菌方面的衛(wèi)生標準時，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
(四)對照試驗：
1.加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液(特別是10:1的稀釋液)，有肘帶有食品顆粒，在這種情況下，為了避免與細菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便在計數(shù)檢樣菌落時用作對照。
2.為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已溶化而保溫于45℃水浴內(nèi)的瓊脂中，按每100ml加lmL，0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5triphenyltetrazoliumchloride，TTC)水溶液之量加入適量的TTC。培養(yǎng)后，如是食品顆粒，不見變化，如為細菌，則生成紅色菌落，配好的TTC溶液，應(yīng)先用來與不加TTC的作對照，以觀察其對計數(shù)是否有不利的作用(TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細菌存在，培養(yǎng)后，在細菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏(formazan)，使菌落呈現(xiàn)紅色。
(五)菌落計數(shù)：
1.從溫箱內(nèi)取出平皿進行菌落計數(shù)時，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內(nèi)平板上菌落生長情況。平行試驗的2個平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近，不同稀釋度的幾個平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大，菌落數(shù)越低，稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。
2.計數(shù)菌落時，應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標準。1個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)；如其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。如在一個稀釋度的兩個平板中，一個平板的菌落數(shù)在30～300之間，另一個大于300或小于30時，則以菌落數(shù)在30～300間的平板作為計數(shù)的標準。
3.注意事項：
(1)如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反比稀釋度小的平板上菌落數(shù)高，則系檢驗工作中發(fā)生的差錯，屬實驗室事故。此外，也可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。
(2)如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時，一個細菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈作為一個菌落計，不要把鏈上生長的各個菌落分開來數(shù)。此外，如皿內(nèi)瓊脂凝固后未及時進行培養(yǎng)而遭受昆蟲侵入，在昆蟲爬過的地方也會出現(xiàn)鏈狀菌落，也不應(yīng)分開來數(shù)。
(3)如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可計作報告，而應(yīng)在稀釋度大的平板上，任意數(shù)其中2cm2個，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)乘以皿底面積63.6ccm2數(shù)，再乘其稀釋倍數(shù)作報告。例如10-1～10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在lO-3稀釋的平板上任數(shù)2個cm2內(nèi)的菌落數(shù)是60個，皿底直徑為9cm，則該檢樣每g(或m1)中“估計”菌落數(shù)為：60/2*63.6*1000=1908000或1.9*106。
63.6cm2數(shù)系按皿底直徑為9cm時計算而得，即：(9/2)2×3.14=63.6；如所用平皿的皿底直徑不是9cm，則可按其直徑的實際cm數(shù)代人圓面積公式求出。
(4)菌落計數(shù)中，也可以選用菌落計數(shù)器則比較方便，燈光由側(cè)面射向平板，菌落易于觀察。由于儀器帶有電子音響訊號，用特制金屬探筆點數(shù)中，在發(fā)出音響之下始顯示數(shù)字增加，不會發(fā)生差錯。且燈光與平板之間夾有多用方格玻質(zhì)規(guī)板(方格面積為1cm2)，也有助于對菌落密布的平板進行計數(shù)。
(5)檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料)，則平板計數(shù)中應(yīng)相應(yīng)地將有關(guān)微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除，不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報告。一般在校正檢樣的pH7.6后，再進行稀釋和培養(yǎng)，此類嗜酸性微生物往往即不易生長。并可用革蘭氏法染色鑒別。染色鑒別時，要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所生成的菌落涂片染色作對照，以咨辨別。酵母菌卵圓形，遠比細菌大，大小為2～5×5～30μm，革蘭氏陽性著色。乳酸桿菌在24小時內(nèi)，于普通營養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長的。
(六)報告方式
1.當檢樣的菌落數(shù)為l～100時，按實有數(shù)報告；大于100時，只記錄左面頭兩位數(shù)字(用兩位有效數(shù)字作報告，可避免產(chǎn)生虛假的概念)，左面第三位數(shù)字則用四舍五入法計算，從第二位數(shù)字之后都記為0，為了縮短數(shù)字后面的0數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示，例如菌落數(shù)為37750時，即可寫成3.8×104。
2.檢樣的菌落數(shù)如系從菌落密布的平板上按比例計算而求得，報告結(jié)果時，應(yīng)在菌落數(shù)前加上“估計”二字。
3.檢樣為固體，用重量法取樣檢驗時，以g為單位報告其菌落數(shù)；檢樣為液體，用容量法取樣檢驗時，以mL為單位報告其菌落數(shù)；如檢樣為樣品表面的涂擦液，則應(yīng)以cm2為單位報告其菌落數(shù)。
4.如檢樣為液體，在兩個平皿內(nèi)所加lmL未經(jīng)稀釋的檢樣(原液)培養(yǎng)中，均無細菌集落生成，則報告為lmL檢樣內(nèi)未有菌落生長，或1mL檢樣內(nèi)菌落數(shù)<1。
